Исследователи обращают внимание на то, что язык Библии в своей основе был старославянским (или церковнославянским). На это было ряд причин. Прежде всего стоит иметь в виду, что данное издание было рассчитано не только на Украину, но и на весь православно-славянский мир. Тут и далее языком церкви и элитарной культуры выступал старославянский язык (даже не принимая во внимание то, что он не был должным образом нормирован).
Значение этого языка возросло в условиях ХVI в., когда обострились конфессионные противостояния. Православные подвергались значительному давлению со стороны мусульман, католиков и протестантов. Наступление конфессионных противников было направлено и против использования старославянского языка. Например, иезуит Петр Скарга в своем полемическом трактате «Про єдність церкви божої…» обращал внимание на то, что данный язык малопригоден для его использования в богословской сфере. В таких условиях для православных консерватизм, в том числе и в языковом вопросе, стал своеобразным бастионом — особенно в плане защиты от католицизма и протестантизма.
Также стоит иметь в виду, что в то время не существовало хороших переводов библейских текстов народными славянскими языками. Соответственно, не было людей, которые бы могли качественно делать это дело. Очевидно, определенную роль сыграл и субъективный фактор. Иван Федорович, роль которого в издании Острожской Библии была далеко не последней, принадлежал к своеобразным православно-славянским «интернационалистам». Он не был привязан к какой-то местной традиции и считал себя «гражданином» православно-славянского мира. Поэтому использовал этот язык в своих изданиях.
И все же язык Острожской Библии несколько отличался от «классических» текстов на старославянском языке. Тут все же есть определенные вкрапления разговорного украинского языка.
Несмотря на то, что Острожску Библию к печати готовили различные специалисты (знатоки сакральных языков и библейских текстов, ученые-филологи, мастера печатного дела), все же главную роль в ее появлении сыграл князь Острожский. Именно он выделил средства, сумел собрать ученых редакторов, пригласил к себе печатника И. Федоровича. По его заданию собирались библейские тексты из разных стран. В конечном счете, он выделил большие средства для работы над Библией и для ее издания.
Острожский выступил в роли вдумчивого, дальновидного мецената, который с большой пользой вложил деньги в нужное дело. Что побуждало князя это сделать? Мотивы этого поступка (во всяком случае, частично) были изложены в предисловии к Библии, написанном от его имени.